发表期刊：Cancers (Basel)

发表日期：2022 Nov 21

影响因子：6.575

DOI:  10.3390/cancers14225721

        原发性肝癌是全球癌症相关死亡的第四大原因，它表现出显著的组织学和生物学异质性。肝细胞癌（HCC）是最常见的类型，占原发性肝癌的90%以上。HCC的主要风险因素包括感染丙型肝炎或乙型肝炎病毒、过度饮酒、吸烟和饮食。遗传风险因素可能与这些环境风险因素相互作用，如CTNNB1（编码β-catenin）、TP53和AXINI基因的突变。

        由于HCC的异质性很强，身体不同区域的肿瘤可能代表不同的亚型。这些亚型在代谢和信号通路上可能有所不同，导致患者生存期的差异。

1）从广西医科大学附属肿瘤医院收集了六对HCC和配对的癌旁正常组织样本，这些样本是在不同的临床阶段被病理诊断为HCC的患者

2）从TCGA数据库中的肝癌（LIHC）数据集中下载了371个原发肿瘤样本、3个复发肿瘤样本和50个正常组织样本的基因表达谱

3）在GEO数据库，获得了GSE14520（225个HCC组织和220个非肿瘤组织）、GSE76427（52个相邻的非肿瘤组织和115个HCC组织）、GSE25097（268个HCC组织和243个邻近的非肿瘤组织）、GSE138178（49个HCC组织和配对的邻近非肿瘤组织）、GSE84006（38个原发性HCC组织和配对的邻近非肿瘤肝组织）、GSE136319数据集（秘鲁患者的47个肿瘤和47个非肿瘤肝脏组织的DNA甲基化数据）

        为了确定与HCC预后相关的基因，作者首先利用TCGA、GSE76427、GSE25097和GSE14520数据集的数据进行了差异分析（图2A,B）。在四个数据集重叠的4036个交叉的DEGs中，有2058个上调，1272个下调，706个DEGs表达方向不同（图2C）。功能富集分析表明，激活了各种与HCC相关的途径，如P53信号通路、色氨酸代谢以及初级胆汁酸生物合成（图2D）。重叠的DEGs可能参与了细胞的氨基酸分解过程、羧酸分解过程和其他代谢过程（图2E）。

        GSEA显示，DEGs与细胞周期、错配修复和DNA复制正相关，但与矿物质吸收、PPAR信号传导以及补体和凝血级联负相关。在GSE14520中，预测HCC患者5年OS的AUC是58%。Cox回归和KM分析也显示，3330个重叠的DEG中，有217个与HCC预后密切相关，而使用Metascape的进一步富集分析显示，这些预后基因在小分子分解代谢、小分子生物合成和有丝分裂细胞周期中明显富集。

        为了评估TCGA和GSE14520中预后相关基因的诊断价值，作者计算了它们的AUC值，并从217个AUC>0.80的预后基因中选出138个（图3A）。然后对这138个基因进行单变量Cox分析，得到10个相对重要性大于0.2的生存相关基因（图3B）。随后的LASSO回归确定了七个特征基因：SORBS2, DHRS1, SLC16A2, RCL1, IGFALS, GNA14和FANCI，预测5年OS的AUC为0.744（图3C-E）。然后用GMM模型将7个特征基因的表达数据整合成3个群组127个组合，并选择AUC最高的群组来识别预测HCC复发的强势特征基因。经GMM分类器测定，127个组合中的1个特征基因的平均准确率为0.9901（图3F）。通过单变量Cox回归分析进一步调查特征基因的独立预后价值，表明FANCI在两个数据集中都与不良的OS显著相关（图3G，H），表明它可能作为HCC复发的一个新的预测生物标志物。

        根据风险评分的中位数将HCC患者分为高风险组和低风险组（图4A,B），在GSE14520和TCGA数据中，其预测1、3、5年OS的AUC值均大于0.65（图4C,D）。使用整合了特征基因和临床病理风险因素的nomogram对OS预测进行了量化（图4E）。校准图也显示，nomogram与理想模型相比表现良好（图4F）。

        为了确定HCC的分子亚型，根据217个预后相关基因对GSE14520和TCGA数据库的HCC样本进行了NMF聚类（图5A-C）。能够将HCC患者分为两个分子亚型（图5C）：预后差的HCC的C1亚型，和OS良好的C2亚型（图5E）。还发现GSE14520的剪影宽度值为0.85（图5D），TCGA的剪影宽度值为0.88，这表明HCC样本与两个不同亚型之间有很好的相关性。

        GSE14520和TCGA中两种HCC亚型的临床数据分布比较表明，两种亚型的年龄没有明显差异，但男性比女性更容易患两种亚型的疾病。此外，根据GSE14520（图6B）和TCGA（图6C）的数据，C1亚型显示出比C2亚型更短的生存期（图6A），以及对CTLA4-R治疗更大的反应性。相反，TCGA中的C2亚型对抗癌药物ZM.447439和AG.14699的反应性明显大于C1亚型（图6D）。

        根据干性指数值对HCC样本进行排名，显示其临床人口学特征与mRNAi明显相关（图S4A）。FANCI与干性指数正相关（图S4B），它在GSE138178和GSE84006数据集中都是上调的（图S4C，D）。利用Oncomine数据库进一步分析FANCI在各种癌症类型中的mRNA表达，发现FANCI在肝癌中与正常组织相比明显上调（图S4E）。这些结果被TCGA RNA测序数据在TIMER中证实，表明FANCI在肿瘤中的水平明显高于邻近的正常组织（图S4F）。

        为了探索FANCI在HCC预后中的作用，作者进行了时间-ROC分析，结果显示，在GSE14520数据集中预测5年OS的AUC最高（图7A），而在TCGA中预测1、3、5年OS的AUC都大于0.60（图7B）。FANCI的AUC在所有四个数据集中都高于0.90（图7C）。富集分析显示，FANCI与纤维蛋白溶解的调节、环氧酶P450途径和蛋白激活级联呈正相关，而与错配修复、中心体分离和转体合成呈负相关（图7D）。此外，FANCI与细胞周期、DNA复制和蛋白酶体正相关，而与FOXO、IL-17和p53信号通路负相关（图7E）。

        还发现在人类蛋白质图谱数据库中，FANCI在HCC组织中的表达高于对照组（图8A）。同样，6名HCC患者的转录组测序结果显示，与邻近患者相比，FANCI在HCC中高表达，特别是在肿瘤进展的患者2（RFS 66天）和5（RFS 248天）（图8B-D）。同时，FANCI在以前的研究中被确定为Wnt信号的下流基因，调节HCC的早期复发。这些结果提示，它可能正向调节范可尼贫血症的途径（图8E）。

        为了探索免疫细胞浸润在HCC中的潜在临床意义，作者确定了所有四个数据集的浸润水平（图9A）。与对照组相比，HCC样本中T辅助2型（Th2）、T辅助和前树突状细胞明显上调，而T细胞和细胞毒性细胞与C1亚型明显相关（图9B）。还分析了HCC组织中24种免疫细胞类型之间的相关性（图9C），并构建了四个集群，显示了彼此之间的正负相关（图9D）。此外，树突状细胞和Th12细胞与七个特征基因相关，而Th2细胞和FANCI之间有明显的相关性（图9E）。CIBERSORT算法还显示，大多数浸润的免疫细胞是T细胞（图9E）。

        根据显示至少20倍覆盖率的测序数据，在364名HCC患者中鉴定了体细胞单核苷酸变异。发现突变使肿瘤抑制基因TP53（占所有患者的31%）、AXINI（8%）和RB1（5%）失活（图S5A）。此外，发现FANCI在HCC患者中有两个位点发生突变，这些突变可能会影响蛋白功能（图S5B）。进一步发现FANCI的mRNA水平与蛋白水平呈负相关，这意味着该基因会受到甲基化的影响（图S5D）。对GSE136319中秘鲁肝癌患者HCC和非肿瘤组织之间差异甲基化的基因分析表明，甲基化修饰被调查（图S5C）。此外，MEXPRESS工具显示，TCGA中FANCI启动子区域的甲基化水平在HCC样本中明显高于正常组织。

        作者利用生物信息学比较了肿瘤和非肿瘤组织之间的基因表达，以确定HCC分子亚型和生物标志物来帮助预测预后。此外，使用单样本基因集富集分析（ssGSEA）来确定免疫浸润的水平并描述肿瘤免疫微环境的特征。本研究确定了HCC患者的两种分子亚型，并检测了可能作为HCC潜在生物标志物和治疗目标的关键基因。